前沿研究
快速检测低浓度细菌的联合法
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日期：2023.11.25
属于：前沿研究
细菌检测在医疗、环境和食品安全领域至关重要，Federico Schaumburg团队开发了一种经过预浓缩步骤(IMS和ITP)，再使用微流体纸基分析装置(μPADs)检测低浓度细菌的方法。
该方法分为两个步骤。在第一步预浓缩中，将样品与抗体修饰的磁性颗粒和偶联到β-半乳糖苷酶(β-gal)的游离抗体混合。利用免疫磁分离技术(IMS）对目标细菌进行分离和浓缩。然后将分离的细菌与氯酚红-β-半乳糖苷(CPRG)孵育，随细菌浓度变化发生不同程度颜色变化。第二步，利用等速电泳微流控纸基分析装置（ITP μPADs）对CPR和CPRG进行分离和聚集，CPR和CPRG形成两个可见色带，分别作为测试带和控制带，利用双波段分析检测结果。
IMS结合ITP μPADs操作步骤
等速电泳(ITP)是一种电分离技术，将样品置于两个储层之间的通道中，在不同储层中填充尾随电解质(TE)、先导电解质(LE)，TE和LE电泳迁移率分别是最低和最高的。在阴离子ITP中施加电场时，电解质从迁移率最高到最低重新排列。
该实验将μPAD IMS−ITP方法与IMS联合μPAD的方法进行了比较，IMS联合μPAD.检测大肠杆菌方法包括IMS、酶偶联和比色检测等几个步骤，这些常见步骤的示意图见图1a。μPAD IMS−ITP方法与IMS联合μPAD方法前几个步骤一致，差别在将IMS处理后的样品与CPRG溶解在TE中重悬最后，在ITP μPAD中进行ITP。比色检测包括鉴定检测线和对照线。或使用数码显微镜拍摄ITP过程，以进行进一步的图像处理。这些步骤如图1c所示。
图 1细菌检测方法简图。(a) IMS和酶偶联步骤。(b)检测方法，IMS处理后的样品与CPRG在纸孔中孵育(c)改进方法，将IMS处理后的样品与CPRG在微离心管中孵育，并对分析物进行后等速电泳预浓缩和分离，形成测试带和对照带。
当引入IMS处理的样品并通电进行ITP μPAD时，有两种可能的情况:（1）IMS处理的样品不含目标细菌浓度或低于ITP系统LOD。在这种情况下产生较少的CPR，ITP μPAD后将形成一条可见的黄色CPRG带。（2）IMS处理的样品中细菌的浓度高于LOD。在这种情况下，出现黄色的CPR带和红色的CPR带两个可见波段。
两个条带同时出现难以用肉眼区分，实验中测试了两种不同技术用于峰分离和提供定量信息。第一种方法将具有迁移率ΩPCPR>ΩPS>ΩPCPRG 的无色化学物质S加入TE溶液中，作为隔离剂分离CPR和CPRG。缓冲液MOPS满足此关系(见表1)。
表 1不同种的无孔通道和纸电泳迁移率
第二种方法是图像处理。利用数码显微镜对ITP μPAD的图像进行了分析，发现绿色通道强度只与CPR浓度有关，过滤了CPRG带。因此，从绿色通道得到了CPR的校准曲线。两种方法相比，使用化学间隔剂方法用于分离测试带和对照带，使两条带更容易可视化。图2b显示了所研究的MOPS浓度所获得的CPRG和CPR峰分离。
图 2 (a)使用MOPS获得的CPRG和CPR峰，间隔1mM。(b) CPR和CPRG峰之间的距离(黑叉)，以及CPR(灰色方块)和CPRG(灰色菱形)的半宽度与MOPS浓度的关系。
IMS - Well及IMS - ITP检测大肠杆菌结果如图3所示。两种方法相比，LODIMS - ITP比LODIMS - Well好106倍，并且耗时更短。在IMS - ITP方法中CPRG与CPR能够完全分离避免产生干扰。
图3 在三种不同的孵育时间(a) tinc = 30分钟，(b) tinc = 20分钟，(c) tinc = 10分钟)进行ITP后，在6分钟内获得的大肠杆菌浓度的CPR峰值强度函数。(d) IMS - well试验中的CPR浓度估计，绿色通道的反向颜色强度与大肠杆菌浓度的关系
图4显示了阳性和阴性(空白)样品的波段，在两个阳性样本中可以看到测试带和控制带，而在阴性样本中只有控制带存在。
图4 不同的大肠杆菌浓度ITP通道,测试区和控制区用矩形点表示
在大肠杆菌污染的苹果汁中分别进行IMS - wel、IMS - ITP检测。 LODIMS - well = 9.2 × 107 CFU/mL, LODIMS - ITP = 9.2 × 102 CFU/mL。食品样品中LODIMS - ITP提高了2个数量级，可能是苹果汁的pH值干扰了第一步Ab与大肠杆菌的结合。
图5 (a)IMS - well法检测不同大肠杆菌浓度的苹果汁样品对应CPR浓度(b)IMS - ITP法检测不同大肠杆菌浓度的苹果汁样品对应CPR峰值浓度。在(a)和(b)中，浅灰色水平带表示空白不确定度。(c)IMS - ITP法检测含有9.2 × 107 CFU/mL大肠杆菌的苹果汁样品获得的检测和对照带
该实验结合IMS、ITP以及μPADs技术，开发了一种快速、灵敏的用于检测食品、环境或生物样品中的低浓度细菌污染的方法，所需设备价格低廉、便于携带。
该方法分为两个步骤。在第一步预浓缩中，将样品与抗体修饰的磁性颗粒和偶联到β-半乳糖苷酶(β-gal)的游离抗体混合。利用免疫磁分离技术(IMS）对目标细菌进行分离和浓缩。然后将分离的细菌与氯酚红-β-半乳糖苷(CPRG)孵育，随细菌浓度变化发生不同程度颜色变化。第二步，利用等速电泳微流控纸基分析装置（ITP μPADs）对CPR和CPRG进行分离和聚集，CPR和CPRG形成两个可见色带，分别作为测试带和控制带，利用双波段分析检测结果。
IMS结合ITP μPADs操作步骤等速电泳(ITP)是一种电分离技术，将样品置于两个储层之间的通道中，在不同储层中填充尾随电解质(TE)、先导电解质(LE)，TE和LE电泳迁移率分别是最低和最高的。在阴离子ITP中施加电场时，电解质从迁移率最高到最低重新排列。
该实验将μPAD IMS−ITP方法与IMS联合μPAD的方法进行了比较，IMS联合μPAD.检测大肠杆菌方法包括IMS、酶偶联和比色检测等几个步骤，这些常见步骤的示意图见图1a。μPAD IMS−ITP方法与IMS联合μPAD方法前几个步骤一致，差别在将IMS处理后的样品与CPRG溶解在TE中重悬最后，在ITP μPAD中进行ITP。比色检测包括鉴定检测线和对照线。或使用数码显微镜拍摄ITP过程，以进行进一步的图像处理。这些步骤如图1c所示。
图 1细菌检测方法简图。(a) IMS和酶偶联步骤。(b)检测方法，IMS处理后的样品与CPRG在纸孔中孵育(c)改进方法，将IMS处理后的样品与CPRG在微离心管中孵育，并对分析物进行后等速电泳预浓缩和分离，形成测试带和对照带。当引入IMS处理的样品并通电进行ITP μPAD时，有两种可能的情况:（1）IMS处理的样品不含目标细菌浓度或低于ITP系统LOD。在这种情况下产生较少的CPR，ITP μPAD后将形成一条可见的黄色CPRG带。（2）IMS处理的样品中细菌的浓度高于LOD。在这种情况下，出现黄色的CPR带和红色的CPR带两个可见波段。
两个条带同时出现难以用肉眼区分，实验中测试了两种不同技术用于峰分离和提供定量信息。第一种方法将具有迁移率ΩPCPR>ΩPS>ΩPCPRG 的无色化学物质S加入TE溶液中，作为隔离剂分离CPR和CPRG。缓冲液MOPS满足此关系(见表1)。
表 1不同种的无孔通道和纸电泳迁移率
第二种方法是图像处理。利用数码显微镜对ITP μPAD的图像进行了分析，发现绿色通道强度只与CPR浓度有关，过滤了CPRG带。因此，从绿色通道得到了CPR的校准曲线。两种方法相比，使用化学间隔剂方法用于分离测试带和对照带，使两条带更容易可视化。图2b显示了所研究的MOPS浓度所获得的CPRG和CPR峰分离。图 2 (a)使用MOPS获得的CPRG和CPR峰，间隔1mM。(b) CPR和CPRG峰之间的距离(黑叉)，以及CPR(灰色方块)和CPRG(灰色菱形)的半宽度与MOPS浓度的关系。IMS - Well及IMS - ITP检测大肠杆菌结果如图3所示。两种方法相比，LODIMS - ITP比LODIMS - Well好106倍，并且耗时更短。在IMS - ITP方法中CPRG与CPR能够完全分离避免产生干扰。
图3 在三种不同的孵育时间(a) tinc = 30分钟，(b) tinc = 20分钟，(c) tinc = 10分钟)进行ITP后，在6分钟内获得的大肠杆菌浓度的CPR峰值强度函数。(d) IMS - well试验中的CPR浓度估计，绿色通道的反向颜色强度与大肠杆菌浓度的关系图4显示了阳性和阴性(空白)样品的波段，在两个阳性样本中可以看到测试带和控制带，而在阴性样本中只有控制带存在。
图4 不同的大肠杆菌浓度ITP通道,测试区和控制区用矩形点表示在大肠杆菌污染的苹果汁中分别进行IMS - wel、IMS - ITP检测。 LODIMS - well = 9.2 × 107 CFU/mL, LODIMS - ITP = 9.2 × 102 CFU/mL。食品样品中LODIMS - ITP提高了2个数量级，可能是苹果汁的pH值干扰了第一步Ab与大肠杆菌的结合。
图5 (a)IMS - well法检测不同大肠杆菌浓度的苹果汁样品对应CPR浓度(b)IMS - ITP法检测不同大肠杆菌浓度的苹果汁样品对应CPR峰值浓度。在(a)和(b)中，浅灰色水平带表示空白不确定度。(c)IMS - ITP法检测含有9.2 × 107 CFU/mL大肠杆菌的苹果汁样品获得的检测和对照带该实验结合IMS、ITP以及μPADs技术，开发了一种快速、灵敏的用于检测食品、环境或生物样品中的低浓度细菌污染的方法，所需设备价格低廉、便于携带。
